BIOLOGICKÉ CENTRUM AV ČR, v. v. i. | Existují viry? Virus mozaiky tabáku aneb Dokažte, že Země není placka

Viry neexistují, virologie je podvod a virologové podvodníci nebo alespoň intelektuální nepoctivci, slepě věřící nikdy neprokázaným dogmatům - tedy alespoň podle spolku Resetheus, který jako jeden ze svých cílů deklaruje “obnovu základního étosu vědy”. Odhlédněme nyní od otázky, zda lze vůbec “obnovovat étos” čehokoliv tím, že označíme druhé za podvodníky, a pojďme se nyní věnovat viru mozaiky tabáku (TMV), na vědecké důkazy jehož existence a vlastností se nás oficiální cestou táže spolupracovnice spolku Resetheus. Nevíme, zda naše odpověď bude uspokojivá pro tazatelku, zcela jistě by mohla být ale zajímavá a přínosná pro ostatní zájemce o vědu - takže se do toho s chutí pusťme.

(pozn.: tento text je rozšířenou a doplněnou verzí původní odpovědi ze dne 1.3.2023 tak, jak bylo v této odpovědi tazatelce avizováno - "článek, který bude rozebírat celou problematiku podrobněji")

Viry jsou miniaturní balíčky genetické informace, která se množí v buňkách. Mimo buňku tyto balíčky neprokazují žádné životní pochody, řada z nich (zejména neobalené rostlinné viry) se dá i vykrystalizovat - podobně, jako např. solný roztok, i když postupy krystalizace jsou v tomto případě rozdílné. Viry jsou tedy takoví neživí buněční parazité, množící se díky energii a “vybavení” buněk, které sami nemají. Množení viru je pro buňky energeticky náročné a může vést až k jejich poškození (další poškození může způsobit i vlastní obranná reakce organizmu) - v řadě případů tedy množení viru vyvolá nějakou chorobu. Další viry jsou schopny množit se i relativně “nenápadně”, bez vyvolání nějakých příznaků na úrovni organizmu - na úrovni buněk jsou ale důsledky množení většinou viditelné a je evidentní, že virus je pro buňku cizorodý element, který se množí a šíří na jejich úkor, čemuž se buňky i celý organizmus snaží bránit.

Mozaiková choroba tabáku byla popsána už na přelomu 19. a 20. století. Jaké jsou ale důkazy, že za vznikem a šířením této choroby stojí částečky výše popsaných vlastností, do té doby neznámé, které nyní nazýváme virus mozaiky tabáku (TMV)? Cesta k poznání TMV byla klikatá a dlouhá, ale stručně by se její historie dala shrnout do následujících bodů:

1.) U náchylných druhů vyvolávala chorobu pouze šťáva/tkáň z nemocných rostlin - šťáva/tkáň ze zdravých rostlin chorobu nevyvolávala. Původce choroby byl menší než bakterie.

a) původce choroby procházel bakteriálními filtry a v nemocných rostlinách nebyly zjištěny žádné bakterie (ani další tehdy známé patogeny či jejich části)
b) chorobu vyvolávala u náchylných druhů šťáva nebo tkáň z pouze nemocných rostlin - šťáva/tkáň ze zdravých, k chorobě náchylných rostlin onemocnění nevyvolávala
c) podobné výsledky byly zjištěny i u dalších chorob (později prokázaných jako virové) - původce procházel bakteriálními filtry a chorobu u citlivých druhů vyvolávala pouze šťáva z nemocných rostlin
d) rozvíjející se serologie prokázala, že v nemocných rostlinách existuje něco, co nebylo nikdy zjištěno v rostlinách zdravých

a) původce choroby procházel bakteriálními filtry a v nemocných rostlinách nebyly zjištěny žádné bakterie (ani další tehdy známé patogeny či jejich části):

“Yet I have found that the sap of leaves attacked by the mosaic disease retains its infectious qualities even after filtration through Chamberland filter-candles” (Ivanovsky, 1892)

“Zunächst ergab sich, dass der Saft kranker Pflanzen, über Porzellan filtriert, wodurch alle Aëroben zurückgehalten wurden, infectionsfähig bleibt. Doch habe ich mich dabei nicht mit dem Suchen nach Aëroben allein beschäftigt, sondern anch mühevolle Versuche für den Nachweis von Anaëroben im Bougiesaft ausgeführt, allein mit negativen Resultate, sodass der verwendete Saft vollständig steril erschien.” (Beijerinck, 1898)

(Překlad: “Nejprve se ukázalo, že míza nemocných rostlin, filtrovaná přes porcelánové fitry, které by zadržely všechny aerobní organismy, zůstává schopná vyvolat infekci. Nezabýval jsem se však pouze hledáním těchto aerobních organizmů, ale prováděl jsem i pracné testy na zjištění anaerobních látek ve filtrované šťávě, pouze s negativními výsledky, takže použitá šťáva působila zcela sterilně.”

b) chorobu vyvolávala u náchylných druhů šťáva nebo tkáň z pouze nemocných rostlin - šťáva/tkáň ze zdravých, k chorobě náchylných rostlin onemocnění nevyvolávala

První testy proběhly samozřejmě s rostlinami tabáku, které byly k chorobě náchylné a příznaky choroby na nich byly dobře patrné. U druhů, na kterých se choroba projevovala charakteristickými příznaky, ji bylo možné vyvolat inokulací šťávy nebo filtrátu z viditelně nemocné rostliny, případně transplantací tkáně z nemocné rostliny či jejím naroubováním na citlivou, zdravou rostlinu.

“Sap from healthy plants does not produce the disease, as I have proved experimentally - although to some it may seem superfluous to have tried this.” (Mayer, 1886)

“Ebenso wenig kann ich die neueste Angabe von Woods bestätigen, nach welcher die Ansteckung mit der Mosaikkrankheit auch bei Impfung mit Saft gesunder Pflanzen geschieht. In meinen Versuchen entwickelte sich die Krankheit unter solchen Bedingungen nie.” (Ivanovsky, 1903; v reakci na práci Woodse z roku 1899)

(Překlad: “Nemohu potvrdit ani poslední Woodsovo tvrzení, podle kterého k nákaze mozaikovou chorobou dochází i při očkování šťávou zdravých rostlin. V mých experimentech se nemoc za takových podmínek nikdy nerozvinula.”)

c) podobné výsledky byly zjištěny i u dalších chorob (později prokázaných jako virové) - chorobu u citlivých druhů vyvolávala pouze šťáva z nemocných rostlin:

Např. při pokusech o přenos podobné “mozaikové choroby brambor” z bramboru na rajčata zjistil Smith (Smith, 1929), že chorobu vyvolává pouze šťáva z nemocných, nikoliv však zdravých rostlin (při pokusech o přenos choroby z bramboru na rajčata):

“The inoculated plants were held for at least four weeks, in some cases for six weeks or more. In no case was any disease produced in the tomatoes. In several instances leaves were taken from the inoculated tomatoes and again inoculated into a second generation of six to eight young tomatoes without producing any symptoms in them. I have had no case where a potato, which had been shown to be normal on preliminary testing, produced disease in tomato. It seems clear that in this country and with these varieties of potato, potato protoplasm as such does not produce virus disease in tomato, and it is reasonable to suppose that the same would hold good of other varieties as well.”

(Překlad: “Inokulované rostliny byly udržovány po dobu alespoň čtyř týdnů, v některých případech po dobu šesti týdnů nebo déle. V žádném případě se u rajčat nevyskytla žádná choroba. V několika případech byly z naočkovaných rajčat odebrány listy a znovu naočkovány do druhé generace šesti až osmi mladých rajčat, aniž by se u nich projevily jakékoli příznaky. Nezaznamenal jsem žádný případ, kdy by brambor, který se předběžným testováním ukázal jako normální, způsobil onemocnění v rajčatech. Zdá se jasné, že v této zemi a u těchto odrůd brambor jejich protoplazma jako taková nevyvolává virovou chorobu u rajčat a je rozumné předpokládat, že totéž by platilo i pro jiné odrůdy.”)

Mozaiku bramboru vyvolávala ale velmi ochotně a jednoznačně šťáva z nemocných brambor:

“On the other hand, leaves from mosaic potatoes have invariably produced in tomato a definite disease, and up to the present all the inoculated tomatoes have shown it”.

(Překlad: Na druhé straně listy z mozaikových brambor vždy způsobily v rajčatech jednoznačnou chorobu a až dosud to vykazovala všechna naočkovaná rajčata“.)

d) rozvíjející se serologie prokázala, že v nemocných rostlinách existuje něco, co nebylo nikdy přítomno v rostlinách zdravých:

Filtrovaná šťáva z nemocných i zdravých rostlin po injekčním vpravení do pokusných zvířat vyvolala vždy tvorbu celé skupiny protilátek (séra) proti všem možným proteinům ve filtrátu. Část séra vytvořeného proti šťávě z nemocných rostlin ale nereagovala se šťávou ze zdravých rostlin - nemocné rostliny tedy obsahují něco navíc, co nebylo nikdy zjištěno ve zdravých rostlinách (Dvorak, 1927; Purdy, 1929, Purdy-Beale, 1931).

V této fázi ještě nebylo jasné, co je oním původcem choroby - bylo ale jasné, že je menší než bakterie, že je přenosný na další rostliny (infekční), a že se nevyskytuje ve zdravých rostlinách.

Příčinou choroby nemůže být zároveň mechanické poškození, neboť stejné experimenty provedené se šťávou ze zdravých rostlin chorobu nevyvolaly. Přítomnost nějaké infekční částice, která není součástí rostlin naznačovaly v této době už i serologické studie.

2.) Ze šťávy nemocných rostlin byly izolovány a přečištěny částice, které chorobu vyvolávaly. Přečištěné částice byly 100-1000x infekčnější než původní šťáva

a) purifikované tyčinkovité částice (virus) jsou 1000x infekčnější než původní filtrovaná šťáva
b) virus byl purifikován čistě a byl izolovatelný i z dalších rostlin naočkovaných TMV
c) stejné tyčinkovité částice nebyly nikdy izolovány ze zdravých rostlin
d) po fyzikálním nebo chemickém poškození ztrácejí tyčinky svoji infekčnost
e) krystalické “inkluze” pozorované optickým mikroskopem pouze v nemocných rostlinách jsou složeny ze stovek právě těchto tyčinkovitých částic

V této fázi již vysoká infekčnost přečištěných tyčinek dokazovala, že tyto částice (nebo jejich součást) jsou příčinou choroby tabáku.

V roce 1935 Stanley publikoval (Stanley, 1935) shrnutí svých dosavadních experimentů - ze šťávy z nemocných rostlin purifikoval částice, které chorobu vyvolávaly. Kromě toho zjistil, že:

a) purifikované částice (virus) jsou 1000x infekčnější než původní filtrovaná šťáva:

“The crystals are over 100 times more active than the suspension made by grinding up diseased Turkish tobacco leaves, and about 1,000 times more active than the twice-frozen juice from diseased plants. One cubic centimeter of a 1 to 1,000,000,000 dilution of the crystals has usually proved infectious.”

Zároveň Stanley znovu potvrdil průchod viru bakteriálními filtry, a zjistil, že ho lze zadržet nitrocelulózovými filtry (které ale propouští např. velkou molekulu vaječného albuminu) - tekutina po takové filtraci je neinfekční a zároveň neobsahuje TMV částice. Vidíme, že chorobu tak nemohou vyvolat potenciální menší molekuly nečistot, které teoreticky v purifikátu viru stále mohou být:

“That the molecule is quite large is also indicated by the fact that the protein is held back by collodion filters through which proteins such as egg albumin readily pass. Collodion filters which fail to allow the protein to pass also fail to allow the active agent to pass. The material readily passes a Berkefeld "W" filter.”

b) virus byl purifikován čistě a byl izolovatelný i z dalších rostlin naočkovaných TMV:

Sérologické testy potvrdily, že virus TMV byl purifikován čistě a nejsou zde žádné příměsi, které se vyskytují v buňkách běžně a vyvolávaly by reakci protilátek (kdyby zde byly, zvířata injikovaná roztokem krystalů by vytvořila protilátky i proti nim, sérum by pak reagovalo i s roztokem ze zdravé rostliny - to se ale nedělo). Zároveň je to důkaz, že virus se vyskytuje pouze v nemocných rostlinách (sérum proti přečištěnému viru nereagovalo s ničím ze zdravých rostlin):

“The sera of animals injected with tobacco-mosaic virus give a precipitate when mixed with a solution of the crystals diluted as high as 1 part in 100,000. The sera of animals injected with juice from healthy tobacco plants give no precipitate when mixed with a solution of the crystals. Injection of solutions of the crystals into animals causes the production of a precipitin that is active for solutions of the crystals and juice of plants containing tobacco-mosaic virus but that is inactive for juice of normal plants.”

V dalších studiích byl stejný protein/virus byl izolován a přečištěn z rajčat infikovaných původním TMV (Loring a Stanley, 1937). Opět byl daleko infekčnější než surový filtrát z nemocných rostlin:

“This crystalline protein was obtained from the globulin fraction of extracts of diseased Turkish tobacco plants, and was found to be over 100 times as active as the crude juice from the diseased plants used as starting material. The chemical composition, optical rotation, and infectivity of the crystalline protein remained unchanged after ten successive recrystallizations. These facts have suggested that the protein is essentially pure and is the agent responsible for the tobacco mosaic disease.”

Překlad: “Tento krystalický protein byl získán z globulinové frakce extraktů nemocných rostlin tureckého tabáku a bylo zjištěno, že je více než 100krát tak aktivní než surová šťáva z nemocných rostlin použitá jako výchozí materiál. Chemické složení, optická rotace a infekčnost krystalického proteinu zůstaly nezměněny po deseti po sobě jdoucích rekrystalizacích. Tyto skutečnosti naznačují, že protein je v podstatě čistý a je činitelem odpovědným za onemocnění tabákové mozaiky.”

Další studie prokázaly, že:

c) po fyzikálním nebo chemickém poškození ztrácejí tyčinky svoji infekčnost:

To, že za infekci může skutečně onen vykrystalizovaný protein podpořil Stanley v roce 1936 také studií (Stanley, 1936), ve které prokázal, že vykrystalizovaný virus lze inaktivovat chemickymi činidly nebo UV-světlem. “Protein” je mírně modifikovaný, ale není schopen vyvolat chorobu po inokulaci na tábák (narozdíl od neinaktivovaného “proteinu”) ani ho poté není možné z inokulovaného tabáku vyizolovat.

To, že purifikované viry lze takto fyzikálně/chemicky inaktivovat, a že to tedy jsou částice, které způsobují příslušnou chorobu, potvrzují i současné experimenty s dalšími viry (např. Jeong a Choi, 2017; nebo Predmore a kol., 2015)

d) krystalické “inkluze” pozorované optickým mikroskopem pouze v nemocných rostlinách jsou složeny ze stovek právě těchto tyčinkovitých částic:

Krystalické inkluze v nemocných rostlinách popisuje už Ivanowski (1903), Steere a Williams (1953) byli schopni vyjmout tyto krystalické inkluze z rostliny a zjistili, že jsou po rozpuštění infekční, a že jsou tvořeny samými tyčinkovitými částicemi TMV:

“Numerous local lesions developed on leaves inoculated with a suspension of these dissolved crystals containing 9 x 10^7 particle/ml and a few were observed on leaves inoculated with a suspension containing 9 x 10^6 particles/ml. No lesions developed, however, on leaves inoculated with suspensions containing 9 x 10^5 particles/ml.”

“By electron microscopy it is found that the crystals consist apparently of nothing but particles of tobacco mosaic virus and a volatile solvent.” (Steere a Williams, 1953)

Částice viru byly purifikovány bez nežádoucích příměsí a bylo několikerým způsobem potvrzeno, že jsou zodpovědné za vyvolání choroby v rostlině (přímou inokulací přečištěných částic rozpuštěných v pufru vs. inokulací pufru samotného, poškození částic vedlo ke ztrátě jejich infekčnosti).

Tvrzení na stránkách Resetheus.org o tom, že “žádný virus nebyl nikdy purifikován” je nepravdivé. Ve skutečnosti řada virů (nejen rostlinných) byla přečištěna z roztoku - zvláště ty, které mají pouze proteinový obal (nikoliv ještě lipidovou membránu).

3.) Bylo prokázáno, že částice se v napadených rostlinách množí. Zároveň nebyly nikdy nalezeny ve zdravých rostlinách

a) množení tyčinkovitých částic TMV v napadených rostlinách bylo potvrzeno přímým měřením jejich koncentrace
b) studie opakovaně potvrdily, že tyto částice nejsou přítomny ve zdravých rostlinách, které byly k chorobě náchylné

a) množení tyčinkovitých částic TMV v napadených rostlinách bylo potvrzeno přímým měřením jejich koncentrace

To, že virus se v buňkách množí (zvyšuje počet svých částic) naznačují už Staneleyho pokusy výše - do zdravých kytek inokuloval protein, a vždy získal opět dostatečné množství pro další inokulaci. Množení viru (zvyšování jeho koncentrace v rostlině) bylo pak také přímo měřeno:

“Curves showing the increment in number of virus particles following inoculation have been obtained for tobacco mosaic virus multiplying in plants of White Burely tobacco and for tomato bushy-stunt virus multiplying in plants of Datura meteloides.” (Steere, 1952)

“The logarithmic portion of the normal increment curve (fig. 2) shows a doubling of virus content every 4 hr.” (Steere, 1952; týká se TMV)

Milne (1966) zjistil, že do 15h po inokulaci purifikátu zředěného pufrem nebyly pozorovány žádné částice TMV, poté se jejich počet zvyšoval. Žádné částice TMV nebyly pozorovány ani po inokulaci čistého pufru (bez purif. částic):

“Particles resembling TMV were seen in nearly every palisade cell examined in samples fixed 15 or more hours after TMV inoculation . Numbers of particles increased with age of infection . No such particles were seen in TMV-inoculated samples fixed at 10 hours, 5 hours, and half an hour after inoculation, nor in any samples inoculated with phosphate buffer only.”

b) studie opakovaně potvrdily, že tyto částice nejsou přítomny ve zdravých rostlinách:

Virus také nebyl nikdy izolován ze zdravých, na infekci citlivých rostlinách nejen v první studii Staleyho (1935), ale i v dalších pracech (např. Bawden a Pirie, 1936; Stanley, 1937; Steere, 1952).

“The sap of tobacco and tomato plants infected with strains of tobacco mosaic virus, after clarification by centrifuging, contains five to ten times as much protein as sap from simmilarly treated uninfected plants. This extra protein can be precipitated from dilute salt solutions at around pH 3.4 and ffrom neutral solutions with from 10 to 12 per cent ammonium sulphate. The protein in uninfected sap is not precipitated under these conditions.” (Bawden a Pirie, 1936)

“No virus protein was obtained from the normal juice preparation to which no virus protein had been added,..”(Stanley, 1937)

(Překlad: “Žádný virový protein nebyl získán z normální šťávy, do které před tím nebyl žádný virový protein přidán, …)

Pozn.1: V této práci Stanley (Stanley, 1937) testoval citlivost své metody detekce a zkoumal, zda lze vyizolovat stejné viry/proteiny i zpětně ze šťávy zdravých kytek (označuje ji jako “normal juice”), když do ní přidá purifikovaný (přečištěný) virus. Jako kontrola sloužila stejná šťáva bez přídavku viru - ta virus nikdy neobsahovala.
Pozn.2: protože virus se dal vykrystalizovat podobně jako jiné proteiny, považoval ho Stanley nejprve za čistý protein. Až později sám ověřil, že jde o kombinaci RNA a proteinu (viz dále)

“It should be mentioned that no particles resembling those characteristic of TMV were ever observed in any of the preparations of samples obtained prior to inoculation of the various sets of plants” (Steere, 1952)

- tj. před inokulací tyto částice ve zdravých rostlinách nebyly

Bylo prokázáno přímo množení (zvyšování počtu) tyčinkovitých částic TMV v rostlině.

Tvrzení spolku Resetheus, že za infekci by mohlo být zodpovědné “potírání rostlin jedovatým roztokem” (a obecně, že za virovými infekcemi je ve skutečnosti intoxikace organizmu) je tedy nesmyslné - jedovaté látky se v daném organizmu nemnoží, což u virů pozorujeme.

4.) Bylo zjištěno, že částice sestávají z molekul proteinu obalujícího RNA. Chorobu vyvolávala i jen samotná tato RNA

a) bylo zjištěno složení částice viru TMV - jedná se o RNA obalenou proteinem
b) čistá RNA a čistý protein se ve zkumavce byly schopny sestavit do podoby viru - infekci způsobovala RNA a projevy choroby odpovídaly typu RNA
c) změny v RNA způsobily změnu v projevu/intenzitě choroby - důkaz jejich přímého ovlivnění virovou RNA
d) dále bylo zjištěno, že krystaly, viditelné optickým mikroskopem v nemocných rostlinách jsou složeny právě z těchto částic a bylo experimentálně proměřeno, že částice viru se v rostlině množí. Množení virové RNA probíhalo mechanizmem nezávislým na buněčném

a) bylo zjištěno složení částice viru TMV - jedná se o RNA obalenou proteinem:

Stanleyho purifikaci infekčních částic potvrdili hned následující rok také Bawden a kol. (1936). Navíc ale ukázali, že se nejedná o čistý krystalický protein, jak si Stanley původně myslel, ale že částice sestává také z RNA (ribonukleová kyselina). To potvrdili o další rok později další práce Bawdena a Pirie (Bawden a Pirie, 1937) i samotného Stanleyho (Stanley, 1937b):

“Nucleoproteins with characteristic optical properties have been isolated from solanaceous plants infected with three strains of tobacco mosaic virus but not from healthy plants. These proteins are infective at a dilution of 1/10¹⁰ and give specific precipitates with antisera at a dilution of 1/10⁷” (Bawden a Pirie, 1937)

“Protein prepared and dialyzed at hydrogen ion concentrations between pH 3 and 7 was found to have nucleic acid associated with it.” (Stanley, 1937b)

Virová RNA byla poté izolována z purifikovaných virových částic a její charakteristiky byly proměřeny v různých studiích (např. Loring, 1939; Cohen a Stanley, 1942). Bylo jasné, že RNA je součástí purifikovaných částic. Tato skutečnost byla potvrzena i pomocí elektronového mikroskopu - např. Hart (1955) pomocí RNázy odštěpil přesahující vlákna z natrávených virových částic a výsledek zobrazil elektronovým mikroskopem.

“The ribonucleic acid in tobacco mosaic virus appears to be localized in a central core running the length of the rod-shaped virus particle. This conclusion is based on (a) observation of partially degraded particles from which project fibers some 30-40 A in diameter; (b) lability, of the fibers fil trace concentrations of ribonuclease; (c) observation of a hole or channel at the center of short rods of X-protein, which contains no nucleic acid.”

Pozn.: Řada následujících studií pak znalost stavby viru TMV dále zpřesnila včetně toho, že RNA neleží v centrální "děrované" části, ale kousek od ní směrem dovnitř ve speciálním žlábku, a je tedy tak chráněna před vnějším prostředím z obou stran. Na tom měla mimochodem docela velkou zásluhu také Rosalind Franklinová (viz Franklin, 1955), která měla lví podíl na objasnění struktury DNA.

b) čistá RNA a čistý protein se ve zkumavce byly schopny sestavit do podoby viru - infekci způsobovala RNA a projevy choroby odpovídaly typu RNA

Infekčnost RNA prokázal např. Fraenkel-Conrat (1955, 1956). Zároveň vytvořil hybridní virus, za použití dvou různých proteinů TMV (ze dvou různých kmenů TMV), které se lišily o několik aminokyselin. S nimi zkombinoval RNA z několika různých kmenů a ponechal složit/rekonstituovat v roztoku tak, jak bylo dříve provedeno. Jednotlivé kombinace vyvolávaly v rostlinách vždy ty příznaky, které byly charakteristické pro kmen použité RNA (nikoliv proteinu), pokud ale byla použita degradovaná nebo zkrácená RNA, vzniklé částice infekční nebyly:

“Freshly prepared RNA is required for appreciable reaction; degraded RNA, or nucleic acids from other sources, are inactive.”

O rok později udělal Fraenkel-Conrat spolu s Singerem (1957) podobný experiment dokonce se 4 různými kmeny TMV, pokaždé množící se virus vykazoval vlastnosti toho viru, ze kterého byla použita RNA (nikoliv toho, ze kterého byl použit obalový protein):

“These findings strongly suggest that the nucleic acid is the genetic determinant in TMV, and related strains, playing the same decisive role which DNA seems to play in the bacteriophages.”

Ke stejným závěrům o infekčnosti RNA došli např. i Gierer a Schramm (1956) nebo Holoubek (1962) a podobné “sestavovací” experimenty byly provedeny i s dalšími viry - např. Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV - Bancroft a Hiebert, 1967), když před tím tento virus purifikovali (Bancroft a kol., 1967)

To, že za infekcí stojí virový genom (RNA) bylo využito o dvě desetiletí později při experimentech s tzv. “infekčními klony”, kdy byla do rostlin vnesena DNA kopie virového genomu a taktéž byla schopna vyvolat nejen chorobu, ale také tvorbu stejných virových částic, které byly purifikovány a pozorovány v nemocných rostlinách již od roku 1935 (např. Dawson a kol., 1986; Meshi a kol., 1986). Těmito experimenty byly zjištěny podrobnosti o fungování virových proteinů - viz bod 4 dále.

c) změny v RNA způsobily změnu v projevu/intenzitě choroby - důkaz jejich přímého ovlivnění virovou RNA:

Změny v RNA ovlivňovaly projevy choroby vyvolané tímto virem - například odstraněním speciálního začátku virové RNA (tzv. 5'-cap struktury) výsledný virus ztratil téměř infektivitu ačkoliv sestavené virové částice vypadaly stejně (v elektronovém mikroskopu) a vykazovaly např. stejné reakce s protilátkami jako původní virus:

“We found that it preferentially cleaved the 5’-blocked structure of TMV RNA and that TMV RNA lacking the 5’-blocked structure showed unchanged ability to assemble with the coat protein, but no infectivity.” (Ohno, 1976 - enzymatické odštěpení CAP => viriony se sestavily normálně, ale nebyly infekční)

d) množení virové RNA probíhá mechanizmem nezávislým na buněčném:

později bylo např. zjištěno, že množení virové RNA probíhá nezávisle na tvorbě rostlinné RNA - aktinomycin, který normálně téměř zastavuje syntézu buněčné, nebyl schopen “zastavit” syntézu virové RNA (většina produkované RNA v napadené rostlině byla díky radioaktivnímu značení zjištěna ve vznikajících virových částicích). Mechanizmus vzniku virové RNA tedy musí být nezávislý na mechanizmu, který vyráběl RNA v rostlině:

“The results showed (Fig. 3) that AMD promoted the incorporation of uracil-14C into virus under conditions which inhibited 88% of the normal RNA synthesis, determined simultaneously in healthy tissue.” (Babos a Shearer, 1969) “In established infection, TMV-RNA synthesis and virus assembly proceed uninterrupted, despite the large reduction of the RNA synthesizing activity of comparable healthy cells, at least for several hours after the beginning of the treatment.” (Babos a Shearer, 1969)

5.) Přečtení její dědičné informace odhalilo, že RNA nese pouze geny zajišťující její množení, šíření se z buňky do buňky a ochranu mimo buňku (proteinový obal)

a) virová RNA byla postupně kompletně sekvenována - obsahovala 4 geny, jenž odpovídaly 4 proteinům nalezeným pouze v infikovaných buňkách
b) konce virové RNA vykazovaly odlišnosti od buněčných RNA, které normálně kódují proteiny (mRNA)
c) postupně byly zkoumány a nalezeny funkce jednotlivých proteinů, kódovaných na virové RNA

a) virová RNA byla postupně kompletně sekvenována - obsahovala 4 geny, jenž odpovídaly 4 proteinům nalezeným pouze v infikovaných buňkách:

Kompletní sekvence 6359 písmen virového genomu (RNA z tyčinkovitých částic množících se v buňkách) byla přečtena v roce 1982 (Goelet, 1982), sekvence jeho některých částí byly zjištěny ale už dříve (Guilley a kol., 1979; Lamy a kol, 1975; Zimmern, 1975; Keith a Fraenkel-Conrat, 1975)

Sekvence genů odpovídala pořadí aminokyselin v již dříve zjištěných virových proteinech - nejdříve zjištěno (Anderer, 1960; Tsugita 1960) jeho chemickou sekvenací. Postupně bylo potvrzeno, že podobně genetická informace viru odpovídala i ostatním virovým proteinům, nalezeným mezi tím (např. Scalla a kol., 1976; Sakai a Takebe, 1974; Beier a kol., 1980) pouze v infikovaných rostlinách a kulturách tabákových protoplastů (buněk zbavených buněčné stěny):

“A protein of ca. 150,000 daltons, not detectable in healthy plants, appeared in leaves infected for 2 days or more.” (Scalla a kol., 1976)

“When [14C] leucine was used to label protoplasts, protein extracted from TMV-infected protoplasts yielded in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis three radioactive bands which are absent in protein from uninfected protoplasts (Fig. 2).” (Sakai a Takebe, 1974)

b) konce virové RNA vykazovaly odlišnosti od buněčných RNA, které normálně kódují proteiny (mRNA):

bylo zjištěno, že jeho konec (tzv. 3'-konec) je odlišný od konců buněčných RNA kódujících proteiny (mRNA), které obyčejně obsahují mnohokrát opakované písmeno A (tzv. poly-A konec). Konec virové RNA se ale skládal do struktur připomínající jiný typ buněčné RNA (tRNA), který ale proteiny nekóduje:

“...the 3' noncoding region is 204 nucleotides long and may be folded into a cloverleaf secondary structure bearing a superficial resemblence to a tRNA”

Podobně i na začátku virové RNA (tzv. 5'-konec) byly nalezeny některé odchylky od buněčných RNA kódujících proteiny (mRNA), které nebyly známy u vyšších eukaryot - viz Zimmern, 1975; Keith a Fraenkel-Conrat, 1975.

To, že podobné typy RNA se v buňkách rostlin (ani živočichů) normálně nevyskytují tak jen dokládalo cizorodost viru (pro rostliny a živočichy) a jeho povahu nebuněčného parazita.

c) postupně byly zkoumány a nalezeny funkce jednotlivých proteinů, kódovaných na virové RNA:

Bylo zjištěno, že protein zodpovědný za šíření viru z buňky do buňky se hromadí v plazmodezmatech - “tunelech” propojující jednotlivé buňky u rostlin - a zvětšuje jejich průměr tak, že jimi může projít virová RNA obalená proteiny:

“...the 30K protein label was associated with plasmodesmata of both stages (Table 1) and was localized inside the channels of plasmodesmata (Figs . 3A, B). " (Tomenius et al. , 1987)

Wolf a kol. (1989) prokázali, že tento virový protein (MP) zvětšuje průměr plazmodezmat až 10x:

"We now show that the expression of the TMV MP gene in transgenic plants can alter the size exclusion limit of plasmodesmata." (Wolf a kol., 1989)

"On this basis, the molecular size exclusion limit (Stokes radius) of plasmodesma in control tobacco plants would be approximately 0.73 nm, whereas that of plasmodesmata in plants that express the 30-kD MP would be greater than 2.4 nm but less than 3.1 nm." (Wolf a kol., 1989)

6.) Molekulární metody umožnily nejen přímé zviditelnění množení viru v rostlině, ale také jeho využití v biotechnologiích

a) zviditelnění průběhu množení a infekce pomocí modifikovaných virů s připojenou fluorescenční látkou
b) množení a šíření viru v buňkách začalo být využíváno v biotechnologiích

a) zviditelnění průběhu množení a infekce pomocí modifikovaných virů s připojenou fluorescenční látkou:

K jednomu z genů (typicky obalový protein nebo protein zajišťující šíření viru z buňky do buňky) připojen gen pro fluorescenční barvičku tak, že při množení viru vzniká původní protein s připojeným fluorescenčním proteinem. Díky němu lze poté sledovat nejen množení viru, ale také jeho šíření v buňce nebo v rostlině.

Např. Christensen a kol. (2009) takto zdokumentoval šíření viru v inokulovaném listu i v dalších listech (kam se virus dostává vodivými pletivy), ale taktéž pohyb jednotlivých virových částic po síti endoplazmatického retikula (označeného jinou fluorescenční barvičkou pomocí protilátek vázajících se na jeden z jeho proteinů).

Podobné experimenty byly provedeny i s dalšími rostlinnými i živočišnými viry a prokázaly tak nejen, že virové částice inokulované do rostlin, rostlinných protoplastů, nebo živočišných buněk na Petriho miskách se v daných buňkách nejen množí (intenzita signálu a jeho plocha v buňce rostla), ale také šíří z buňky do buňky (barevný signál se po čase objevil i v sousedních buňkách):

Šíření rostlinných virů bylo pozorováno pomocí fluorescence např. v případě Pepino mosaic viru, PepMV (Sempere a kol., 2011; Ruiz a kol., 2019), šíření TuMV (blízkého příbuzného viru TMV) bylo dokumentováno ve studiích Agbeci a kol. (2013) nebo Wan a kol. (2015); šíření viru mozaiky květáku (CaMV) zdokumentovali Dáder a kol. (2019).

Množení a šíření virů v buňkách bylo - díky infekci virů s modifikovaným genomem - pozorováno i v případě virů živočišných: např. u viru Zika (ZIKV) pomocí vložení krátké sekvence 12 aminokyselin do virového proteinu, který byl pak v buňkách dodatečně obarven (Li a kol., 2022).

Nebo v případě viru chřipky A, IAV (Influenza A virus), kdy vědci zkoumali jeho šíření nejen na klasických buňkách “na misce”, ale také v 3D simulaci respiračního traktu, sestavené z vrstev různých buněk (Möckel a kol., 2022)

b) množení a šíření viru v buňkách začalo být využíváno v biotechnologiích:

připojit k některému z virových proteinů (úpravou příslušného genu na virové RNA) se nemusí jen fluorescenční barvička - může se jednat o molekuly (nebo jejich části), které potřebujeme namnožit ve velkém počtu pro nějaký další účel. K tomu se nejčastěji využívá obalový protein viru, kterého v napadených rostlinách vzniká velké množství.

Tímto způsobem byl např. vytvořen upravený virus TMV291, jehož obalový protein obsahuje 12 aminokyselin z proteinu původce malárie - parazitického prvoka (Plasmodium circumsporozoite). Díky tomu, že tento kousek je vystaven na povrchu viru (TMV), mohl se po jeho izolaci z rostlin použít k přípravě protilátek proti tomuto parazitu (Turpen et al. 1995).

Další využití nejen TMV, ale i mnoha jiných rostlinných virů lze získat v přehledové literatuře, např. Venkataraman a Hefferon (2021), Lee a kol. (2021)

7.) Bylo zjištěno, jakými způsoby se virus může v přírodě přenášet, a že ho najdeme v relativně vysoké koncentraci nejen v půdách kolem napadených rostlin, ale také v povrchových vodách

Kromě mechanického přenosu popsaného ve výše uvedených bodech, a který v přírodě jistě může nastat při vzájemném otěru rostlin (např. ve větru), popř. jejich mechanickému poškození, je významným přenašečem viru v současnosti člověk, při práci s rostlinami (poškození nemocných i zdravých rostlin stejným nářadím bez předchozí dezinfekce - infekčnost šťávy z nemocných rostlin byla prokázána výše, experimenty prokázaly přenos i pomocí jemného otěru sterilní látky o list nemocné a poté zdravé rostliny - Losenge a kol. (2012)). Ze důvodů snadné přenosnosti šťávou nakažené rostliny může být virus přenesen také při okusu rostlin hmyzem (sarančata, housenky, atp.) nebo zvířaty.

Další studie (Sacristán a kol., 2011) zkoumala přenos pomocí otěru listů nemocné a zdravé rostliny o sebe (přirozenější než inokulace pomocí karborundového prášku) - prokázala schopnost viru přenést se, i když je koncentrace viru v nakažené rostlině relativně malá. Více efektivní byl přenos z mladých listů a z listů infikovaných systémově (tj. díky šíření viru v rostlině, nikoliv tak, že byly primárním zdrojem infekce/inokulace):

“One set of plants was inoculated by brushing the recipient leaf once with the source leaf; the other set was inoculated by brushing the recipient leaf 10 times with the source leaf. In this way, the transmission efficiency during a single contact event (1 brush) and the transmission efficiency during a more prolonged contact (10 brushes) were compared. In each source leaf, TMV accumulation in the area that had been in contact with the recipient leaf was quantified. At 4 days postinoculation, the recipient Xanthi-nc tobacco leaves were collected and local lesions were counted.” (Sacristán a kol., 2011)

Nadto bylo zjištěno, že virus je vylučován do půdy kořeny, i když jeho následný příjem zdravou rostlinou je pouze v případě propojení kořenových systémů u sebe rostoucích rostlin (Park a kol., 1999):

“The analysis of the virus concentration in the nutrient solution showed that though the inoculum source plants released virus through their roots, the released virus concentration in the nutrient solution did not reach a high enough concentration to be the minimum for infection. This might be the reason that the separated test plants did not become infected. However, when test plants and inoculum source plants were grown together side by side, their roots made contact and root-tips grafted with each other. It might be possible that the virus could move from diseased plants to healthy plants through a root-tip graft so that the tested plants become inoculated.”

Virus TMV byl prokázán i v povrchových vodách (např. Tošić a Tošić, 1984; Piazolla a kol., 1986; Zhang a kol., 2023) a zalévání kořenů rostlin touto vodou u nich vyvolalo opět typické příznaky choroby a virus byl v rostlině potvrzen PCR testem (rostlina zalévaná sterilní vodou žádné příznaky neměla a její PCR test byl negativní):

“A typical plant virus, TMV, was selected as a model for the root irrigation test, and the plants showed typical symptoms of TMV after two weeks (Fig 6A), and PCR result confirmed the presence of TMV (Fig 7).” (Zhang a kol., 2023)

Podobně byly ve vodách zjištěny a podrobeny testům na infekčnost i další viry - např. blízký příbuzný TMV, virus ToMV (Tomato mosaic virus). Infekční virus byl taktéž izolován z povrchových vod, a jak po inokulaci na rostliny, tak i po zalévání rostlin touto vodou se v řadě případů objevily příznaky typické choroby ToMV, virus byl poté rostlině dokázán dalšími metodami jako RT real-time PCR, ELISA a elektronová mikroskopie (např. Boben a kol., 2007):

“Plant tissue was analysed using quantitative ToMV-specific real-time PCR. The plants which had been watered with a diluted elution fraction tested ToMV-positive with an estimate concentration of 4.0 × 10−9 mg ml−1. The concentration of ToMV in plants watered with original irrigation water from the gravel pit in Ivanci was estimated to be at the limit of detection (LOD) for the method: 4.2 × 10−10 mg ml−1. The plants used as a control had Ct values below those corresponding to our LOD in the test.” (Boben a kol., 2007)”

Tyto studie samozřejmě nepřinášejí přímý důkaz, že virus byl takto přenesen v jednotlivých konkrétních případech infekcí v zahradách, sklenících nebo polích, ale ilustrují dostatečně možnost, že k takovémuto přenosu může dojít i přirozenou cestou.

Závěr

Výše uvedené body dokládají, že částice viru TMV byl nejen přečištěny z nemocných rostlin a jednoznačně identifikovány jako původce dříve popsané mozaiky tabáku, ale byly v dalším výzkumu rozebrány doslova “do posledního šroubku” a funkce jednotlivých částí byla důkladně zkoumána. Jedná se o kousky dědičné informace, uložené ve formě molekul RNA obalených proteinem. Tyto kousíčky se prokazatelně množí v buňkách, kam se dostanou různými cestami z okolního prostředí, a obsahují pouze geny zajišťující množení a šíření této částice. Podobně byla prokázána existence a šíření i dalších (nejen) rostlinných virů. S využitím moderních metod dnes můžeme dokonce sledovat množení a šíření virů “v přímém přenosu” v živých buňkách nebo je využít v biotechnologiích.

Samozřejmě, že stále existuje celá řada slepých míst (i u viru mozaiky tabáku, TMV), která se teprve zkoumají. Existence viru TMV (stejně jako existence dalších virů) a to, že se jedná o buněčné parazity, mezi ně ale rozhodně nepatří. Spolek Resetheus proto na svých stránkách šíří scestné informace nejen o viru mozaiky tabáku, ale i o virech obecně, když tvrdí, že “žádný virus nebyl nikdy izolován”, “nebyly provedeny řádné kontrolní experimenty” nebo “nebylo prokázáno šíření virů v přírodě”.

S využitím citované literatury zpracoval: Mgr. Ondřej Lenz, Ph.D.
(vytvořeno: 8.3.2023; poslední aktualizace: 14.4.2023)

Přiložené soubory:

- Dotaz podle zákona o svobodném přístupu k informacím (14.2.2023) [JPG soubor]

- Odpověď na žádost (1.3.2023) [PDF soubor]

- Oprava chybné citace a formulací a zveřejnění podrobnější odpovědi (10.3.2023) [PDF soubor]

- Vyjádření k bodům 1-13 mimo režim InfoZákona (námitky tazatelky k údajné správnosti odpovědí) [PDF soubor]

Literatura

Agbeci M, Grangeon R, Nelson RS, Zheng H, Laliberté JF. Contribution of host intracellular transport machineries to intercellular movement of turnip mosaic virus. PLoS Pathog. 2013;9(10):e1003683. doi: 10.1371/journal.ppat.1003683

Bancroft JB, Hiebert E. Formation of an infectious nucleoprotein from protein and nucleic acid isolated from a small spherical virus. Virology. 1967 Jun;32(2):354-6. doi: 10.1016/0042-6822(67)90284-x.

Bancroft JB, Hills GJ, Markham R. A study of the self-assembly process in a small spherical virus. Formation of organized structures from protein subunits in vitro. Virology. 1967 Feb;31(2):354-79. doi: 10.1016/0042-6822(67)90180-8

Bawden, F. C., Pirie, N. W., Bernal, J. D. & Fankuchen, I. 1936 Liquid crystalline substances from virus-infected plants. Nature 138, 1051^1052.

Bawden, F. C. & Pirie, N. W. 1937 The isolation and some properties of liquid crystalline substances from solanaceous plants infected with three strains of tobacco mosaic virus. Proc. R. Soc. Lond. B 123, 274^320.

Beier, H., Mundry, K. W., & Issinger, O.-G. (1980). In vivo and in vitro Translation of the RNAs of Four Tobamoviruses. Intervirology, 14(5-6), 292–299. doi:10.1159/000149199

Boben, J., Kramberger, P., Petrovič, N. et al. Detection and quantification of Tomato mosaic virus in irrigation waters. Eur J Plant Pathol 118, 59–71 (2007). https://doi.org/10.1007/s10658-007-9112-1

Dáder B, Burckbuchler M, Macia J-L, Alcon C, Curie C, Gargani D, et al. (2019) Split green fluorescent protein as a tool to study infection with a plant pathogen, Cauliflower mosaic virus. PLoS ONE 14(3): e0213087. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0213087

Dawson, W.O.; Beck, D.L.; Knorr, D.A.; Grantham, G.L. cDNA cloning of the complete genome of tobacco mosaic virus and production of infectious transcripts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83, 1832–1836.

Dvorak, M., The effect of mosaic on the globulin of potato, J. Infect. Dis., 1927,xli, 215-221.

Cohen SS, Stanley WM. The molecular size and shape of the nucleic acid of tobacco mosaic virus. J Biol Chem. 1942;144:589–98

FRAENKEL-CONRAT H, SINGER B. Virus reconstitution. II. Combination of protein and nucleic acid from different strains. Biochim Biophys Acta. 1957 Jun;24(3):540-8. doi: 10.1016/0006-3002(57)90244-5

Fraenkel-Conrat H, Williams RC. RECONSTITUTION OF ACTIVE TOBACCO MOSAIC VIRUS FROM ITS INACTIVE PROTEIN AND NUCLEIC ACID COMPONENTS. Proc Natl Acad Sci U S A. 1955 Oct 15;41(10):690-8. doi: 10.1073/pnas

FRANKLIN, R. Structure of Tobacco Mosaic Virus. Nature 175, 379–381 (1955). https://doi.org/10.1038/175379a0

GIERER, A., & SCHRAMM, G. (1956). Infectivity of Ribonucleic Acid from Tobacco Mosaic Virus. Nature, 177(4511), 702–703. doi:10.1038/177702a0

Guilley, H., Jonard, G., Kukla, B. & Richards, K. E., 1979. Sequence of 1,000 nucleotides at the 3'-end of tobacco mosaic virus RNA. Nucl. Acids Res. 6, 1287-1308

Hart RG. ELECTRON-MICROSCOPIC EVIDENCE FOR THE LOCALIZATION OF RIBONUCLEIC ACID IN THE PARTICLES OF TOBACCO MOSAIC VIRUS. Proc Natl Acad Sci U S A. 1955 May 15;41(5):261-4. doi: 10.1073/pnas.41.5.261.

HOLOUBEK V. Mixed reconstitution between protein from common tobacco mosaic virus and ribonucleic acid from other strains. Virology. 1962 Nov;18:401-4. doi: 10.1016/0042-6822(62)90030-2

Christensen N, Tilsner J, Bell K, Hammann P, Parton R, Lacomme C, Oparka K. The 5' cap of tobacco mosaic virus (TMV) is required for virion attachment to the actin/endoplasmic reticulum network during early infection. Traffic. 2009 May;10(5):536-51. doi: 10.1111/j.1600-0854.2009.00889.x

Jeong RD, Choi HS. Inactivation of tobacco mosaic virus using gamma irradiation and its potential modes of action. Acta Virol. 2017;61(2):223-225. doi: 10.4149/av_2017_02_14

Ivanovsky, D. 1903. On the mosaic disease of tobacco. Z. Pflanzenkr. Pflanzenpathol. Pflanzenschutz

Keith, J. & Fraenkel-Conrat, H. 1975 Tobacco mosaic virus RNA carries 5'-terminal triphosphorylated guanosine blocked by 5'-linked 7-methylguanosine. FEBS Lett. 57, 31-33

Lamy, D., Jonard, G., Guilley, H. & Hirth, L. 1975 Comparison between the 3'OH end RNA sequence of two strains of tobacco mosaic virus which may be aminoacylated. FEBS Lett.
60, 202-204.

Lee KZ, Basnayake Pussepitiyalage V, Lee YH, Loesch-Fries LS, Harris MT, Hemmati S, Solomon KV. Engineering Tobacco Mosaic Virus and Its Virus-Like-Particles for Synthesis of Biotemplated Nanomaterials. Biotechnol J. 2021 Apr;16(4):e2000311. doi: 10.1002/biot.202000311

Li S, Wang D, Ghulam A, Li X, Li M, Li Q, Ma Y, Wang L, Wu H, Cui Z, Zhang XE. Tracking the Replication-Competent Zika Virus with Tetracysteine-Tagged Capsid Protein in Living Cells. J Virol. 2022 Apr 13;96(7):e0184621. doi: 10.1128/jvi.01846-21

Loring H.S. (1939) Properties and hydrolytic products of nucleic acid from tobacco mosaic virus. Journal of Biological Chemistry, 130: 251-258.

Loring H.S., W.M. Stanley. ISOLATION OF CRYSTALLINE TOBACCO MOSAIC VIRUS PROTEIN FROM TOMATO PLANTS. Journal of Biological Chemistry 1937, 117 (2) , 733-754.

Mayer, Adolf (1886). "Über die Mosaikkrankheit des Tabaks". Die Landwirtschaftliche Versuchs-stationen (in German). 32: 451––467. Translated into English in Johnson, J., Ed. (1942) Phytopathological classics (St. Paul, Minnesota: American Phytopathological Society) No. 7, pp. 11–-24.

Meshi, T.; Ishikawa, M.; Motoyoshi, F.; Semba, K.; Okada, Y. In vitro transcription of infectious RNAs from full-length cDNAs of tobacco mosaic virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83, 5043–5047.

Milne, R. G. (1966). Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells. Virology, 28(1), 79–89. doi:10.1016/0042-6822(66)90308

Möckel, M.; Baldok, N.; Walles, T.; Hartig, R.; Müller, A.J.; Reichl, U.; Genzel, Y.; Walles, H.; Wiese-Rischke, C. Human 3D Airway Tissue Models for Real-Time Microscopy: Visualizing Respiratory Virus Spreading. Cells 2022, 11, 3634. https://doi.org/10.3390/cells11223634

Ohno T, Okada Y, Shimotohno K, Miura K, Shinshi H. Enzymatic removal of the 5'-terminal methylated blocked structure of tobacco mosaic virus RNA and its effects on infectivity and reconstitution with coat protein. FEBS Lett. 1976 Aug 15;67(2):209-13. doi: 10.1016/0014-5793(76)80368-7

Park, W. M., Lee, G. P., Ryu, K. H., & Park, K. W. (1999). Transmission of tobacco mosaic virus in recirculating hydroponic system. Scientia Horticulturae, 79(3-4), 217–226. doi:10.1016/s0304-4238(98)00215-5

Predmore A, Sanglay GC, DiCaprio E, Li J, Uribe RM, Lee K. Electron beam inactivation of Tulane virus on fresh produce, and mechanism of inactivation of human norovirus surrogates by electron beam irradiation. Int J Food Microbiol. 2015 Apr 2;198:28-36. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2014.12.024

Purdy, H. A. (1929). IMMUNOLOGIC REACTIONS WITH TOBACCO MOSAIC VIRUS. Journal of Experimental Medicine, 49(6), 919–935. doi:10.1084/jem.49.6.919

Purdy-Beale HP. Specificity of the precipitin reaction in tobacco mosaic disease. J Exp Med. 1931 Sep 30;54(4):463-73. doi: 10.1084/jem.54.4.463. PMID: 19869933; PMCID: PMC2132021.

Sakai, F., & Takebe, I. (1974). Protein synthesis in tobacco mesophyll protoplasts induced by tobacco mosaic virus infection. Virology, 62(2), 426–433. doi:10.1016/0042-6822(74)90404-8

Scalla, R., Boudon, E. & Rigaud, J. 1976 Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoretic detection of two high molecular weight proteins associated with tobacco
mosaic virus infection in tobacco. Virology 69, 339-345

Sempere RN, Gómez P, Truniger V, Aranda MA. Development of expression vectors based on pepino mosaic virus. Plant Methods. 2011 Mar 11;7:6. doi: 10.1186/1746-4811-7-6

SIEGEL, A., WILDMAN, S. G., & GINOZA, W. (1956). Sensitivity to Ultra-violet Light of Infectious Tobacco Mosaic Virus Nucleic Acid. Nature, 178(4542), 1117–1118. doi:10.1038/1781117a0

SCHRAMM, G., SCHUMACHER, G., & ZILLIG, W. (1955). An Infectious Nucleoprotein from Tobacco Mosaic Virus. Nature, 175(4456), 549–550. doi:10.1038/175549a0

Smith J.H. (1929) THE TRANSMISSION OF POTATO MOSAIC TO TOMATO. Ann. Biol. XV

Stanley WM. (1935) ISOLATION OF A CRYSTALLINE PROTEIN POSSESSING THE PROPERTIES OF TOBACCO-MOSAIC VIRUS. Science. 81(2113):644-5. doi: 10.1126/science.81.2113.644. PMID: 17743301.

Stanley, W. M. (1936). THE INACTIVATION OF CRYSTALLINE TOBACCO-MOSAIC VIRUS PROTEIN. Science, 83(2165), 626–627.

STANLEY, W.A. (1937a) Chemical studies on the virus of tobacco mosaic X. The activity and yield of virus protein from plants diseased for different periods of time, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 121: 205.

Stanley, W. M. (1937b) Chemical studies on the virus of tobacco mosaic. VIII. The isolation of a crystalline protein possessing the properties of aucuba mosaic virus. J. Biol. Chem. 117, 325^340.

Steere, Russell L. “Virus Increment Curves Obtained from Counts of Particles in Clarified Plant Juice.” American Journal of Botany 39, no. 3 (1952): 211–20. https://doi.org/10.2307/2438360.

Steere, R. L., & Williams, R. C. (1953). Identification of Crystalline Inclusion Bodies Extracted Intact from Plant Cells Infected with Tobacco Mosaic Virus. American Journal of Botany, 40(2), 81. doi:10.2307/2438849

Tomenius, K., Clapham, D. & Meshi, T. 1987 Localization by immunogold cytochemistry of the virus-coded 30K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology 160, 363-371

Tošić, M., & Tošić, D. (1984). Occurrence of Tobacco Mosaic virus in Water Of the Danube and Sava Rivers. Journal of Phytopathology, 110(3), 200–202. doi:10.1111/j.1439-0434.1984.tb00748.x

Turpen, T. H., Reinl, S. J., Charoenvit, Y., Ho°man, S. L., Fallarme, V. & Grill, L. K. 1995 Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobacco mosaic virus. BioTechnology 13, 53-57

Venkataraman S, Hefferon K. Application of Plant Viruses in Biotechnology, Medicine, and Human Health. Viruses. 2021 Aug 26;13(9):1697. doi: 10.3390/v13091697.

Wan J, Cabanillas DG, Zheng H, Laliberté JF. Turnip mosaic virus moves systemically through both phloem and xylem as membrane-associated complexes. Plant Physiol. 2015 Apr;167(4):1374-88. doi: 10.1104/pp.15.00097

Wolf, S.; Deom, C.M.; Beachy, R.N.; Lucas, W.J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science 1989, 246, 377–379.

Zimmern, D. 1975 The 5'-end group of tobacco mosaic virus RNA is m7GpppGp. Nucl. Acids Res. 2, 1189-1201